非分段负链RNA病毒(nsNSV)，包括埃博拉病毒(EBOV)、狂犬病病毒、人呼吸道合胞病毒和肺病毒，可引起人类和动物的呼吸道感染、出血热和脑炎，并被视为全球重大的健康和经济负担。病毒基因组的复制和转录由大L聚合酶执行，L聚合酶是开发抗病毒药物的有希望的靶标。
2023年9月12日，中国科学院微生物研究所施一、高福及齐建勋共同通讯在Nature 在线发表题为“Molecular mechanism of de novo replication by the Ebola virus polymerase”的研究论文，该研究揭示了埃博拉病毒聚合酶从头复制的分子机制。该研究以EBOV L聚合酶为代表，在酶促实验中发现，L聚合酶的novo复制受EBOV基因组特异性3′先导序列控制，至少3个碱基可以有效地驱动RNA合成的延伸过程，而不依赖于特异性RNA序列。
该研究确定了EBOV L-VP35-RNA复合物的高分辨率结构，并发现3 '先导RNA以独特的稳定弯曲构象结合在模板进入通道中。进一步的突变研究证实了RNA的弯曲构象是RNA从头复制活性所必需的，并揭示了L蛋白中稳定RNA构象的关键残基。这些发现为nsNSV聚合酶的RNA合成提供了新的机制，并揭示了抗病毒药物开发的重要靶点。
负链RNA病毒(NSVs)包括许多高度流行的人类和动物病原体，如埃博拉病毒(EBOV)、拉沙病毒(LASV)、尼帕病毒、狂犬病病毒(RABV)、流感病毒和人类呼吸道合胞病毒(HRSV)。NSVs被认为是对全球经济和公共卫生的重大威胁。因此，更好地了解NSV复制的分子机制和开发新的抗NSV感染的抗病毒药物对于对抗这些病毒至关重要。
根据病毒基因组的组织结构，NSVs可进一步分为包括EBOV在内的非节段NSVs (nsNSVs)和包括流感病毒在内的节段NSVs (sNSVs)。nsNSVs和sNSVs的单链RNA基因组都与病毒核蛋白组装成螺旋构型的病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物。在sNSVs中，每个基因组病毒RNA (vRNA) 片段可以通过在同一病毒群中高度保守的部分互补的5 '和3 '末端形成一个“伪环”。而对于nsNSVs, vRNA的5 ' 和3 '端通常分别位于相反的两端。
所有NSVs编码含有RNA依赖性RNA 聚合酶(RdRP)结构域的大RNA聚合酶，并在vRNPs的背景下复制或转录vRNA基因组。在过去的几年中，作者对sNSVs的复制和转录机制获得了实质性的结构见解，包括正黏液病毒A病毒、B病毒、C病毒和D病毒。许多sNSV RNA聚合酶的结构表明，RNA聚合酶通常具有一个保守的RdRP核心，表现为具有拇指、手指和手掌亚结构域的右手状褶皱，以及其他几个功能结构域，包括核酸内切酶结构域和帽结合结构域。
EBOV L-VP35-RNA复合物的整体结构(图源自Nature )
nsNSVs的聚合酶在基因组3′端启动转录，先导区和内部基因依次转录成先导RNA和具有5′-cap和3′-poly (A)尾结构的单顺反子mRNA。据推测，nsNSVs的转录遵循一种启停机制，通过识别每个病毒基因侧面的基因起始(GS) 和基因结束(GE)信号。每个转录本在各自的GE信号处终止后，聚合酶要么与模板分离，要么在其GS信号处继续下游转录本的合成。对于基因组复制，聚合酶也在基因组的3 '端启动，产生全长补体基因组RNA，忽略所有GS和GE信号。关于聚合酶如何从转录转换到复制的分子机制尚不清楚，这种转换可能受到P蛋白磷酸化或其他转录激活因子状态的调节。
目前，在nsNSV RNA聚合酶复合物的可用结构中未观察到RNA结合。这些聚合酶如何识别基因组和抗基因组RNA中的末端启动子元件仍然是难以捉摸的。先前的研究表明，VSV和RABV L蛋白的N端残基以及P蛋白的C端结构域可能参与病毒RNA的结合，因为它们位于模板RNA进入通道附近。然而，准确的聚合酶-RNA相互作用尚不清楚，这极大地阻碍了人们对nsNSVs RNA复制和转录事件的起始机制的分子理解。EBOV作为非nsNSV的代表，对人类具有高致病性，可引起出血热和多器官衰竭等严重临床症状。EBOV RNP复合体负责病毒RNA合成，而L-VP35复合体是有效RNA聚合活性的基本功能单元。
最近，利用冷冻电镜(cryo-EM)方法解决了EBOV L-VP复合物的整体结构，并清楚地显示了L蛋白中与辅因子VP35四聚体紧密相互作用的活性位点的结构特征。然而，对于识别其vRNA启动子的L蛋白的功能和结构特征知之甚少，这阻碍了对EBOV复制从头起始过程的分子理解。总之，该研究提供了EBOV L聚合酶识别基因组RNA的第一个结构细节，并揭示了nsNSV复制起始的独特机制。这些发现将极大地增强人们对nsNSV RNA聚合酶合成RNA的机制的理解，并为开发针对nsNSV聚合酶的新型抗病毒药物开辟道路。
(来源：iNature)
原文出处：Peng Q, Yuan B, Cheng J, Wang M, Gao S, Bai S, Zhao X, Qi J, Gao GF, Shi Y. Molecular mechanism of de novo replication by the Ebola virus polymerase. Nature. 2023 Sep 12. doi: 10.1038/s41586-023-06608-1. Epub ahead of print. PMID: 37699521.
链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37699521/