随着全球气候变暖，未来全球将面临更多新发或再发病毒引发的传染病疫情。此前的埃博拉病毒、甲型H1N1流感、寨卡病毒、以及最近的新冠病毒肺炎（COVID-19）疫情，都对全球的经济、公共卫生安全、以及人类健康，产生了巨大冲击。除此类突发病毒外，长期潜伏于机体的病毒，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）以及单纯疱疹病毒1型（HSV-1）等，也因其高传染性和反复发作的特点，较难防治。因此，迫切需要建立针对病毒感染的广谱性抗病毒新策略。
但是现有的病毒检测和清除策略均分开独立进行，尚未有集病毒检测和清除为一体的工程化系统。这促使我们设计开发针对病毒的闭环式基因线路，实现体内病毒检测清除一体化、自动化和智能化。
2022年12月9日，Nature Communications刊登了华东师范大学叶海峰研究员团队和杜克-新加坡国立大学医学院王林发院士团队，历时8年在抗病毒免疫领域的最新研究成果Engineering antiviral immune-like systems for autonomous virus detection and inhibition in mice。研究团队设计了一组集病毒检测清除于一体的闭环式免疫样系统ALICE。该系统成功模拟了人体的抗病毒免疫系统，能够自动感应和破坏入侵的病毒（图 1）。该系统以感知外源核酸的STING蛋白为接头，连接人工搭建的信号反应网络，同步输出多重抗病毒功能模块（包含抗病毒细胞因子IFN-α和IFN-β、降解病毒核酸的CRISPR-Cas9、抗病毒中和抗体）。当病毒入侵时，ALICE系统能够自动感知，并同步输出抗病毒功能蛋白，发挥抗病毒效果。
图1 ALICE系统简介
1. 自动感应病毒入侵的ALICEsen传感器
研究团队首先设计构建了ALICEsen传感器，用于测试系统感知病毒的广谱性。通过对ALICEsen传感器中的接头蛋白STING、信号级联传递的操纵子序列/启动子序列进行优化，最终成功实现STING-依赖的七类病毒的广谱性响应。研究团队后续选取HSV-1作为模式病毒，对系统的动力学特征进行探究，发现ALICEsen传感器具有很好的病毒剂量依赖、病毒感染时间依赖以及在不同细胞系中有良好的普适性。
2. 设计构建自动感应和清除病毒的ALICEim系统
研究团队在ALICEsen传感器的基础上，将输出模块中的报告基因替换为具有抗病毒功效的IFN-α和IFN-β，组装自动感应和清除病毒的ALICEim系统。实验结果显示，ALICEim系统一旦发现病毒入侵，立即启动IFN-α或IFN-β的表达，快速清除病毒。ALICEim系统成功模拟了人体的第一道免疫防线——固有免疫系统的抗病毒效果。
3. 设计构建自动感应和降解病毒基因组的ALICECas9系统
为了进一步清除潜伏在人体细胞中的病毒基因组，研究团队又开发了自动感应和降解病毒基因组的ALICECas9系统（图3）。实验结果显示，该系统中Cas9蛋白只有在病毒存在的情况下才会表达，因此形成闭环式基因线路，成功避免了Cas9蛋白持续性表达引起的细胞消耗、脱靶、耐药毒株等诸多安全性问题。同时，研究团队通过串联多重sgRNA，成功实现了腺病毒（ADV）和HSV-1的多病毒同时清除。已有研究显示，CRISPR基因编辑技术在短时间内抑制病毒复制，将会促使病毒处于潜伏状态；一旦核酸酶耗尽，极易造成病毒再度复发。因此，ALICECas9系统成功实现了感应病毒的核酸酶自动输出，将进一步推动CRISPR基因编辑技术在抗病毒领域中的应用。
图2 ALICECas9系统。
4. 设计构建自动感应和的抑制病毒的ALICEAb系统
中和抗体具有良好的病毒抑制效果，但是生产成本高、制备周期长。研究团队开发了自动感应和抑制病毒的ALICEAb系统，成功组装了低成本、调控表达、具有抗病毒功能的中和抗体细胞药物工厂。
5. 设计构建自动感应双重输出抗病毒的ALICECas9+Ab系统
在上述的研究基础上，研究团队建立了响应强度和抑制能力更强大的ALICECas9+Ab系统（图3），从病毒入侵和复制两个角度出发，协同发挥抗病毒效果。研究团队将ALICECas9+Ab基因线路上载至底盘细胞HEK-293T的基因组中，成功筛选出一株抗病毒效果最佳的细胞株HEKALICE-Cas9-E317Ab。实验结果显示，HEKALICE-Cas9-E317Ab细胞株，具有和高浓度抗HSV-1药物阿昔洛韦（ACV）相当的病毒抑制效果，可避免ACV长期使用引发耐药毒株的出现。
图3 ALICECas9+Ab系统。
6. 动物模型体内测试ALICE系统的抗病毒效果
随后，研究团队将ALICE系统上载至底盘细胞中，并由水凝胶包裹移植到小鼠体内。实验结果显示：无论在病毒感染发生的前、中、后期，ALICE系统均能自动感知和抑制病毒。尤其令人兴奋的是，ALICE系统携带的中和抗体输出模块，可在病毒感染后的六小时自动输出，比人体适应性免疫系统产生中和抗体至少提早了一周。
为了进一步探索ALICE系统的临床应用前景，研究团队选取由单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染引发的疱疹性角膜炎（HSK）小鼠模型，由腺相关病毒（AAV）载体递送ALICE系统至小鼠的眼角膜。实验结果显示：ALICE系统能够成功抑制小鼠角膜、三叉神经节以及大脑中的病毒载量；并且面对病毒的迭代感染，也能发挥良好的抗病毒效果。目前，临床上治疗HSV-1的常用方法是抗病毒药物，如阿昔洛韦（ACV）等核苷类似物，这类药物靶点单一，极易造成耐药毒株的出现。ALICE系统的出现无疑是给抗病毒治疗领域，提供了一种灵活、创新、模块化的抗病毒治疗新策略。
总而言之，模块化设计的闭环式ALICE系统，拥有可更换的检测模块、灵活布线的内源信号网络、多重的输出模块，经由不同的底盘细胞或AAV载体递送，能够灵活应用于特定的病原体防控需求（选择合适的控制元件）。
ALICE技术平台作为人造抗病毒免疫系统，可诱导干扰素表达释放发挥非特异性抗病毒免疫功能，或诱导中和抗体等发挥适应性免疫防御，增强机体的免疫防御体系。研究团队认为，本研究中的各类ALICE系统可作为示例模型，未来很容易适应特定免疫样细胞的设计开发，实现以哺乳动物为目标的潜在病原体的智能感应和清除。
据悉，华东师范大学叶海峰研究员和杜克-新加坡国立大学医学院王林发院士为该研究论文的共同通讯作者，华东师范大学博士后王义丹为该研究论文的第一作者。
（来源：BioArtMED）
原文出处：Wang Y, Xu Y, Tan CW, Qiao L, Chia WN, Zhang H, Huang Q, Deng Z, Wang Z, Wang X, Shen X, Liu C, Pei R, Liu Y, Xue S, Kong D, Anderson DE, Cai F, Zhou P, Wang LF, Ye H. Engineering antiviral immune-like systems for autonomous virus detection and inhibition in mice. Nat Commun. 2022 Dec 9;13(1):7629. doi: 10.1038/s41467-022-35425-9. PMID: 36494373.